蛋白質(zhì)組學(xué)

　　研究介紹

　　蛋白質(zhì)組的研究不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。通過(guò)對(duì)正常個(gè)體及病理個(gè)體間的蛋白質(zhì)組比較分析，我們可以找到某些"疾病特異性的蛋白質(zhì)分子"，它們可成為新藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，或者也會(huì)為疾病的早期診斷提供分子標(biāo)志。確實(shí)，那些世界范圍內(nèi)銷(xiāo)路最好的藥物本身是蛋白質(zhì)或其作用靶點(diǎn)為某種蛋白質(zhì)分子。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工作，也能為人類健康事業(yè)帶來(lái)巨大的利益。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進(jìn)入后基因時(shí)代的特征。

　　基本策略

　　蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念最先由MarcWilkins提出，指由一個(gè)基因組(genome)，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)(Protein).蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變.在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾.故一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時(shí)可以超過(guò)基因組的數(shù)目.蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)處于早期“發(fā)育”狀態(tài)，這個(gè)領(lǐng)域的專家否認(rèn)它是單純的方法學(xué)，就像基因組學(xué)一樣，不是一個(gè)封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識(shí)體系，而是一個(gè)領(lǐng)域.蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動(dòng)態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對(duì)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測(cè)定，鑒定疾病、藥物對(duì)生命過(guò)程的影響，以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制.作為一門(mén)科學(xué)，蛋白質(zhì)組研究并非從零開(kāi)始，它是已有20多年歷史的蛋白質(zhì)(多肽)譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的一種延伸.多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)和進(jìn)一步的圖象分析；而基因產(chǎn)物圖譜依靠多種分離后的分析，如質(zhì)譜技術(shù)、氨基酸組分分析等.

　　研究基礎(chǔ)

　　90年代初期開(kāi)始實(shí)施的人類基因組計(jì)劃，在經(jīng)過(guò)各國(guó)科學(xué)家近10年的努力下，已經(jīng)取得了巨大的成就。不僅完成了十余種模式生物（從大腸桿菌、釀酒酵母到線蟲(chóng)）基因組全序列的測(cè)定工作，還在2003年提前完成人類所有基因的全序列測(cè)定。那么，知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，就可以任意控制人的生老病死嗎？其實(shí)并不是這么簡(jiǎn)單?；蚪M學(xué)（genomics）雖然在基因活性和疾病的相關(guān)性方面為人類提供了有力根據(jù),但實(shí)際上大部分疾病并不是因?yàn)榛蚋淖兯斐?。并且，基因的表達(dá)方式錯(cuò)綜復(fù)雜，同樣的一個(gè)基因在不同條件、不同時(shí)期可能會(huì)起到完全不同的作用。關(guān)于這些方面的問(wèn)題，基因組學(xué)是無(wú)法回答的。所以，隨著人類基因組計(jì)劃的逐步完成，科學(xué)家們又進(jìn)一步提出了后基因組計(jì)劃，蛋白質(zhì)組（proteome）研究是其中一個(gè)很重要的內(nèi)容。

　　目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過(guò)基因組測(cè)序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對(duì)那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也大多是通過(guò)同源基因功能類推等方法推測(cè)出來(lái)的。有人預(yù)測(cè)，人類基因組編碼的蛋白至少有一半是功能未知的。因此，在未來(lái)的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測(cè)序工作的完成，人們研究的重點(diǎn)必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標(biāo)。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價(jià)值。

　　基因組(genome)包含的遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的mRNA稱為轉(zhuǎn)錄子組(transcriptome)。很顯然，不同細(xì)胞在不同生理或病理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄子組包含的mRNA的種類不盡相同。mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。同理，不同細(xì)胞在不同生理或病理狀態(tài)下所表達(dá)的蛋白質(zhì)的種類也不盡相同。蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，因此對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。

　　生命科學(xué)是實(shí)驗(yàn)科學(xué)，因此生命科學(xué)的發(fā)展極大地依賴于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展。以DNA序列分析技術(shù)為核心的基因組研究技術(shù)推動(dòng)了基因組研究的日新月異，而以基因芯片技術(shù)為代表的基因表達(dá)研究技術(shù)為科學(xué)家了解基因表達(dá)規(guī)律立下汗馬功勞。在蛋白質(zhì)組研究中，二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)的黃金組合又為科學(xué)家掌握蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律再鑄輝煌。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)就是指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究得到的結(jié)果。

　　蛋白質(zhì)組學(xué)的研究試圖比較細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類和鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。

　　研究?jī)?nèi)容

　　蛋白質(zhì)研究

　　1.蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定研究。

　　2.翻譯后修飾：很多mRNA表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式，因此對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對(duì)闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。

　　3.蛋白質(zhì)功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析?？梢岳没蚯贸头戳x技術(shù)分析基因表達(dá)產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)出來(lái)后在細(xì)胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的一個(gè)很好的工具。

　　4.對(duì)人類而言，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最終要服務(wù)于人類的健康，主要指促進(jìn)分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì)，而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預(yù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

　　在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和疾病機(jī)理研究中，了解人不同發(fā)育、生長(zhǎng)期和不同生理、病理?xiàng)l件下及不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)的特點(diǎn)具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子，進(jìn)一步為設(shè)計(jì)作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。

　　細(xì)胞亞細(xì)胞

　　不同發(fā)育、生長(zhǎng)期和不同生理、病理?xiàng)l件下不同的細(xì)胞類型的基因表達(dá)是不一致的，因此對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的研究應(yīng)該精確到細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平?？梢岳妹庖呓M織化學(xué)技術(shù)達(dá)到這個(gè)目的，但該技術(shù)的致命缺點(diǎn)是通量低。激光捕獲顯微切割LCM(LaserCaptureMicrodissection)技術(shù)可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細(xì)胞類型，因此LCM技術(shù)實(shí)際上是一種原位技術(shù)。取出的細(xì)胞用于蛋白質(zhì)樣品的制備，結(jié)合抗體芯片或二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線，可以對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行原位的高通量的研究。很多研究采用勻漿組織制備蛋白質(zhì)樣品的技術(shù)路線，其研究結(jié)論值得懷疑，因?yàn)榻M織勻漿后不同細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起，最后得到的研究數(shù)據(jù)根本無(wú)法解釋蛋白質(zhì)在每類細(xì)胞中的表達(dá)情況。雖然培養(yǎng)細(xì)胞可以得到單一類型細(xì)胞，但體外培養(yǎng)的細(xì)胞很難模擬體內(nèi)細(xì)胞的環(huán)境，因此這樣研究得出的結(jié)論也很難用于解釋在體實(shí)際情況。因此在研究中首先應(yīng)該將不同細(xì)胞類型分離，分離出來(lái)的不同類型細(xì)胞可以用于基因表達(dá)研究，包括mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。

　　LCM技術(shù)獲得的細(xì)胞可以用于蛋白質(zhì)樣品的制備?？梢愿鶕?jù)需要制備總蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通過(guò)去除白蛋白來(lái)減少蛋白質(zhì)類型的復(fù)雜程度。相關(guān)試劑盒均有廠商提供。

　　二維電泳

　　蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過(guò)二維電泳進(jìn)行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量差異進(jìn)行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。電泳后對(duì)膠進(jìn)行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質(zhì)樣品，然后在同樣條件下進(jìn)行二維電泳，染色后比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的熒光染料標(biāo)記，然后兩種蛋白質(zhì)樣品在一塊膠上進(jìn)行二維電泳的分離，最后通過(guò)熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。

　　膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過(guò)分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，并且對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。通過(guò)專門(mén)的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點(diǎn)所在的膠區(qū)域進(jìn)行精確切割。接著對(duì)膠中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切消化，酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過(guò)點(diǎn)樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析，從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù);這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)或和已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析。

　　LCM-二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線是典型的一條蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線，除此以外，LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線。即通過(guò)LCM技術(shù)獲得感興趣的細(xì)胞類型，制備細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)經(jīng)熒光染料標(biāo)記后和抗體芯片雜交，從而可以比較兩種樣品蛋白質(zhì)表達(dá)的異同。Clontech最近開(kāi)發(fā)了一張抗體芯片，可以對(duì)378種膜蛋白和胞漿蛋白進(jìn)行分析。該芯片同時(shí)配合了抗體芯片的全部操作過(guò)程的重要試劑，包括蛋白質(zhì)制備試劑，蛋白質(zhì)的熒光染料標(biāo)記試劑，標(biāo)記體系的純化試劑，雜交試劑等。

　　對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術(shù)無(wú)疑是很好的研究方法。Clontech開(kāi)發(fā)的酵母雙雜交系統(tǒng)和NEB公司開(kāi)發(fā)的噬菌體展示技術(shù)可供研究者選用。

　　關(guān)于蛋白質(zhì)組的研究，也可以將蛋白質(zhì)組的部分或全部種類的蛋白質(zhì)制作成蛋白質(zhì)芯片，這樣的蛋白質(zhì)芯片可以用于蛋白質(zhì)相互作用研究，蛋白表達(dá)研究和小分子蛋白結(jié)合研究。Science，Vol.293，Issue5537，2101-2105，September14，2001發(fā)表了一篇關(guān)于酵母蛋白質(zhì)組芯片的論文。該文主要研究?jī)?nèi)容為：將酵母的5800個(gè)ORF表達(dá)成蛋白質(zhì)并進(jìn)行純化點(diǎn)樣制作芯片，然后用該芯片篩選鈣調(diào)素和磷脂分子的相互作用分子。

　　最后有必要指出的是，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究注重研究單一蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)組學(xué)注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有的蛋白質(zhì)種類及其與周?chē)h(huán)境(分子)的關(guān)系。因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究通常是高通量的。適應(yīng)這個(gè)要求，蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究工具通常都是高度自動(dòng)化的系統(tǒng)，通量高而速度快，配合相應(yīng)分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，研究者可以在最短的時(shí)間內(nèi)處理最多的數(shù)據(jù)

　　研究意義背景

　　研究意義

　　隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn)，生命科學(xué)研究已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在這個(gè)時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個(gè)物種的基因組被測(cè)序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達(dá)序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)等，都是從細(xì)胞中mRNA的角度來(lái)考慮的，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。但事實(shí)并不完全如此，從DNAmRNA蛋白質(zhì)，存在三個(gè)層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(Transcriptionalcontrol)，翻譯水平調(diào)控(Translationalcontrol)，翻譯后水平調(diào)控(Post-translationalcontrol)。從mRNA角度考慮，實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好，尤其對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，相關(guān)性更差。更重要的是，蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷。毋庸置疑，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。蛋白質(zhì)本身的存在形式和活動(dòng)規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問(wèn)題，仍依賴于直接對(duì)蛋白質(zhì)的研究來(lái)解決。雖然蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特殊性質(zhì)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個(gè)生命過(guò)程。傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已無(wú)法滿足后基因組時(shí)代的要求。這是因?yàn)椋?1)生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)。(2)多個(gè)蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級(jí)聯(lián)因果。(3)在執(zhí)行生理功能時(shí)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的，并不象基因組那樣基本固定不變。因此要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí)，必然要在整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。因此在上世紀(jì)90年代中期，國(guó)際上產(chǎn)生了一門(mén)新興學(xué)科－蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics），它是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象?？梢哉f(shuō)蛋白質(zhì)組研究的開(kāi)展不僅是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代的里程碑，也是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。

　　研究背景

　　雖然第一次提出蛋白質(zhì)組概念是在1994年，但相關(guān)研究可以追溯到上世紀(jì)90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因組計(jì)劃提出之前，就有人提出過(guò)類似的蛋白質(zhì)組計(jì)劃，當(dāng)時(shí)稱為HumanProteinIndex計(jì)劃，旨在分析細(xì)胞內(nèi)的所有蛋白質(zhì)。但由于種種原因，這一計(jì)劃被擱淺。90年代初期，各種技術(shù)已比較成熟，在這樣的背景下，經(jīng)過(guò)各國(guó)科學(xué)家的討論，才提出蛋白質(zhì)組這一概念。

　　國(guó)際上蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展十分迅速，不論基礎(chǔ)理論還是技術(shù)方法，都在不斷進(jìn)步和完善。相當(dāng)多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建立，相應(yīng)的國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站也層出不窮。1996年，澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心：AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF)。丹麥、加拿大、日本也先后成立了蛋白質(zhì)組研究中心。在美國(guó)，各大藥廠和公司在巨大財(cái)力的支持下，也紛紛加入蛋白質(zhì)組的研究陣容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)“SWISSPROT”著稱的蛋白質(zhì)組研究人員成立的，以應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)開(kāi)發(fā)新藥物靶標(biāo)為目的，建立了配備有上百臺(tái)質(zhì)譜儀的高通量技術(shù)平臺(tái)。而當(dāng)年提出HumanProteinIndex的美國(guó)科學(xué)家NormsnG.Anderson也成立了類似的蛋白質(zhì)組學(xué)公司，繼續(xù)其多年未實(shí)現(xiàn)的夢(mèng)想。2001年4月，在美國(guó)成立了國(guó)際人類蛋白質(zhì)組研究組織（HumanProteomeOrganization,HUPO）,隨后歐洲、亞太地區(qū)都成立了區(qū)域性蛋白質(zhì)組研究組織，試圖通過(guò)合作的方式，融合各方面的力量，完成人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃（HumanProteomeProject）。

　　研究技術(shù)

　　可以說(shuō)，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展既是技術(shù)所推動(dòng)的也是受技術(shù)限制的。蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功與否，很大程度上取決于其技術(shù)方法水平的高低。蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠(yuǎn)比基因技術(shù)復(fù)雜和困難。不僅氨基酸殘基種類遠(yuǎn)多于核苷酸殘基（20/4）,而且蛋白質(zhì)有著復(fù)雜的翻譯后修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質(zhì)帶來(lái)很多困難。此外，通過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行蛋白質(zhì)的體外擴(kuò)增和純化也并非易事，從而難以制備大量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的興起對(duì)技術(shù)有了新的需求和挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組的研究實(shí)質(zhì)上是在細(xì)胞水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行分離和分析，往往要同時(shí)處理成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。當(dāng)前在國(guó)際蛋白質(zhì)組研究技術(shù)平臺(tái)的技術(shù)基礎(chǔ)和發(fā)展趨勢(shì)有以下幾個(gè)方面：

　　樣品制備

　　通?？刹捎眉?xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。樣品預(yù)分級(jí)的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí)，如專門(mén)分離出細(xì)胞核、線粒體或高爾基體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級(jí)不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)，還可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。

　　對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標(biāo)記，是蛋白質(zhì)組研究的重要方向之一。但臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一。如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細(xì)胞，而這類細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。所以，常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細(xì)胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較。而蛋白質(zhì)組研究需要的通常是單一的細(xì)胞類型。最近在組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備方面也有新的進(jìn)展，如采用激光捕獲微解剖(LaserCaptureMicrodissection,LCM)方法分離癌變上皮類細(xì)胞。

　　分離和分析

　　利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量通過(guò)雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)是一種很有效的手段。它在蛋白質(zhì)組分離技術(shù)中起到了關(guān)鍵作用。如何提高雙向凝膠電泳的分離容量、靈敏度和分辨率以及對(duì)蛋白質(zhì)差異表達(dá)的準(zhǔn)確檢測(cè)是目前雙向凝膠電泳技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。國(guó)外的主要趨勢(shì)有第一維電泳采用窄pH梯度膠分離以及開(kāi)發(fā)與雙向凝膠電泳相結(jié)合的高靈敏度蛋白質(zhì)染色技術(shù)，如新型的熒光染色技術(shù)。

　　質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。它通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量來(lái)判別蛋白質(zhì)的種類。當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)就是雙向凝膠電泳－質(zhì)譜技術(shù)，即通過(guò)雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一，而最近發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)可以同時(shí)達(dá)到以上三個(gè)要求，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確和大規(guī)模的鑒定。

　　蛋白質(zhì)組研究

　　做過(guò)雙向凝膠電泳的人一定會(huì)抱怨它的繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等缺點(diǎn)。發(fā)展可替代或補(bǔ)充雙向凝膠電泳的新方法已成為蛋白質(zhì)組研究技術(shù)最主要的目標(biāo)。目前，二維色譜(2D-LC)、二維毛細(xì)管電泳(2D-CE)、液相色譜－毛細(xì)管電泳(LC-CE)等新型分離技術(shù)都有補(bǔ)充和取代雙向凝膠電泳之勢(shì)。另一種策略則是以質(zhì)譜技術(shù)為核心，開(kāi)發(fā)質(zhì)譜鳥(niǎo)槍法(Shot-gun)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等新策略直接鑒定全蛋白質(zhì)組混合酶解產(chǎn)物。隨著對(duì)大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究的重視，發(fā)展高通量和高精度的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)技術(shù)也被科學(xué)家所關(guān)注。此外，蛋白質(zhì)芯片的發(fā)展也十分迅速，并已經(jīng)在臨床診斷中得到應(yīng)用。

       蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。丹麥、英國(guó)、美國(guó)等也都建立了各具特色的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。生物信息學(xué)的發(fā)展已給蛋白質(zhì)組研究提供了更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件；特別值得注意的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定軟件和算法發(fā)展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學(xué)、UCSF等都有自主的搜索軟件和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。最近發(fā)展的質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋基因組數(shù)據(jù)庫(kù)使得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可直接進(jìn)行基因注釋、判斷復(fù)雜的拼接方式。隨著基因組學(xué)的迅速推進(jìn)，會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，對(duì)肽序列標(biāo)記的從頭測(cè)序軟件也十分引人注目。

　　蛋白質(zhì)組學(xué)

　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的重要支撐，并將引領(lǐng)生物技術(shù)取得關(guān)鍵性的突破。為幫助生命科學(xué)領(lǐng)域的工作者全面掌握蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)與方法、實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)、研究前沿與熱點(diǎn)，本技術(shù)平臺(tái)將為客戶提供蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)，包括雙向凝膠電泳、等電聚焦、生物質(zhì)譜分析及非凝膠技術(shù)。

　　雙向凝膠電泳

　　雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開(kāi)。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞分化凋亡研究，致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究，療效監(jiān)測(cè)，新藥開(kāi)發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。近年來(lái)經(jīng)過(guò)多方面改進(jìn)已成為研究蛋白質(zhì)組的最有使用價(jià)值的核心方法。

　　等電聚焦

　　等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是60年代中期問(wèn)世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。等電聚焦凝膠電泳依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場(chǎng)中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。

　　生物質(zhì)譜

　　生物質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來(lái)分離并確定分子量。對(duì)于經(jīng)過(guò)雙向電泳分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對(duì)這些肽段用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）。

　　飛行時(shí)間質(zhì)譜

　　MALDI的電離方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，當(dāng)用激光（337nm的氮激光）照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離。它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測(cè)定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽質(zhì)量指紋圖譜，非?？焖伲看畏治鲋恍?~5min），靈敏（達(dá)到fmol水平），可以精確測(cè)量肽段質(zhì)量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。

　　電噴霧質(zhì)譜

　　ESI-MS是利用高電場(chǎng)使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫(kù)侖力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過(guò)程不斷重復(fù)使最終的液滴非常細(xì)小呈噴霧狀，這時(shí)液滴表面的電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI-MS從液相中產(chǎn)生離子，一般說(shuō)來(lái)，肽段的混合物經(jīng)過(guò)液相色譜分離后，經(jīng)過(guò)偶聯(lián)的與在線連接的離子阱質(zhì)譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是分析時(shí)間一般較長(zhǎng)。

　　目前，許多實(shí)驗(yàn)室兩種質(zhì)譜方法連用，獲得有意義的蛋白質(zhì)的肽段序列，設(shè)計(jì)探針或引物來(lái)獲得有意義的基因。隨著蛋白質(zhì)組研究的深入，又有多種新型質(zhì)譜儀出現(xiàn)，主要是在上述質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)與重新組合。

　　發(fā)展回顧

　　核酸與蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的主要大分子。隨著人類基因組等大量生物體全基因組序列的破譯和功能基因組研究的展開(kāi)，生命科學(xué)家越來(lái)越關(guān)注如何用基因組研究的模式開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。正因如此，《Nature》、《Science》在2001年2月公布人類基因組草圖的同時(shí)，分別發(fā)表了“Andnowfortheproteome”和“Proteomicsingenomeland”的述評(píng)與展望，將蛋白質(zhì)組學(xué)的地位提到前所未有的高度，認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)將成為新世紀(jì)最大戰(zhàn)略資源---人類基因爭(zhēng)奪戰(zhàn)的戰(zhàn)略制高點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)雖然問(wèn)世時(shí)間很短，但已經(jīng)在研究細(xì)胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成等方面進(jìn)行了有力的探索，涉及到白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等，鑒定了一批腫瘤相關(guān)蛋白，為腫瘤的早期診斷、藥靶的發(fā)現(xiàn)、療效判斷和預(yù)后提供了重要依據(jù)。

　　鑒于蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展前景的重要性和技術(shù)的先進(jìn)性，西方各主要發(fā)達(dá)國(guó)家紛紛投巨資全面啟動(dòng)蛋白質(zhì)組的研究。如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，美國(guó)能源部、歐共體等均啟動(dòng)了不同生物蛋白質(zhì)組的研究并取得明顯進(jìn)展，一批高質(zhì)量的研究論文相繼在國(guó)際著名學(xué)術(shù)刊物發(fā)表。由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究比基因組學(xué)研究更接近實(shí)用，有著巨大的市場(chǎng)前景，企業(yè)與制藥公司也紛紛斥巨資開(kāi)展蛋白質(zhì)組研究。獨(dú)立完成人類基因組測(cè)序的Celera公司已宣布投資上億美元于此領(lǐng)域；日內(nèi)瓦蛋白質(zhì)組公司與布魯克質(zhì)譜儀制造公司聯(lián)合成立了國(guó)際上最大的蛋白質(zhì)組研究中心。為了促進(jìn)國(guó)家與地區(qū)性的蛋白質(zhì)組的發(fā)展、合作與交流，成立了國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織(HUPO)，在法國(guó)召開(kāi)了首屆國(guó)際蛋白質(zhì)組大會(huì)，并迅即在北美、歐洲、韓國(guó)、日本成立了相應(yīng)的分支機(jī)構(gòu)。蛋白質(zhì)組學(xué)已成為西方各主要發(fā)達(dá)國(guó)家、各跨國(guó)制藥集團(tuán)競(jìng)相投入的“熱點(diǎn)”。

　　主要進(jìn)展

　　啟動(dòng)研究

　　在國(guó)家支持下，中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、復(fù)旦大學(xué)與北京師范大學(xué)等單位迅速啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組研究，建立并組合了二維電泳蛋白質(zhì)組分離技術(shù)、圖象分析技術(shù)和蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜技術(shù)；先后舉辦了三次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)術(shù)研討會(huì)，并在國(guó)際上較早提出了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究戰(zhàn)略。我國(guó)蛋白質(zhì)的色譜/電泳二維分離，二維芯片電泳分離，質(zhì)譜在線鑒定等方面均取得了重要進(jìn)展，并得到了國(guó)際同行的認(rèn)同，具有一定優(yōu)勢(shì)。其中由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院牽頭的“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”成為世界“人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃”的重要組成部分之一。

　　重要成就

　　雖然我國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)研究啟動(dòng)不久，我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)在重大疾病如肝癌、維甲酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡啟動(dòng)模型及維甲酸定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)分化的模型等比較蛋白質(zhì)組研究以及一些重要生理和病理體系的蛋白質(zhì)組成分研究方面獲得了重要成就。在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化前后分離出了19個(gè)與定向誘導(dǎo)神經(jīng)分化相關(guān)的蛋白；在HL-60細(xì)胞凋亡研究中初步篩選到21個(gè)凋亡相關(guān)蛋白。已進(jìn)行了肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞蛋白質(zhì)組的比較分析研究，發(fā)現(xiàn)了兩者間不同的蛋白表達(dá)群；自行建立了肝癌高/低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，進(jìn)行了原位食管癌/轉(zhuǎn)移食管癌間的比較蛋白質(zhì)組研究，初步發(fā)現(xiàn)了一批與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)群。通過(guò)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)肺癌病人和正常人血清中的蛋白質(zhì)譜的對(duì)比分析，找到了15個(gè)差異蛋白并利用BiomarkerPattern分析軟件建立了肺癌診斷分類樹(shù)模型。初步盲篩結(jié)果表明，這15個(gè)分子標(biāo)志可能成為臨床診斷肺癌的新指標(biāo)，有重要應(yīng)用價(jià)值。在大規(guī)模人胎肝蛋白表達(dá)譜方面初步鑒定出500個(gè)高豐度蛋白，150個(gè)磷酸化相關(guān)蛋白等等。這些研究證明了我國(guó)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)已能支撐一定規(guī)模的研究，為我國(guó)在該研究領(lǐng)域爭(zhēng)得了一席之地，也為未來(lái)的發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。

　　目前，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院牽頭的973計(jì)劃項(xiàng)目和由上海生命科學(xué)院牽頭的863計(jì)劃項(xiàng)目集中了國(guó)內(nèi)十余家優(yōu)勢(shì)單位，針對(duì)嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的重大疾病和重要生命科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展“重大疾病的比較蛋白質(zhì)組研究”和“重要生理、病理體系的功能蛋白質(zhì)組研究”。力爭(zhēng)在3~5年內(nèi)建立國(guó)際領(lǐng)先水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究通用技術(shù)平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)一批有重要生命科學(xué)價(jià)值或與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，為探索基因轉(zhuǎn)錄,翻譯調(diào)控的規(guī)律、獲得重大疾病預(yù)警、診斷標(biāo)志物和新藥研究的靶標(biāo)作出貢獻(xiàn)。

　　目前，國(guó)內(nèi)已有若干蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心或重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室相繼成立，如復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組中心，高等院校蛋白質(zhì)組學(xué)研究院，中國(guó)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心等。其中高校蛋白質(zhì)組研究院是由國(guó)內(nèi)多所高校、臨床單位和國(guó)內(nèi)外有關(guān)公司聯(lián)合建立的研究機(jī)構(gòu)，是我國(guó)高校大規(guī)模打破學(xué)校界限，與國(guó)內(nèi)外多方面力量聯(lián)手，進(jìn)軍蛋白組組學(xué)研究領(lǐng)域所采取的新舉措。統(tǒng)一協(xié)調(diào)有關(guān)國(guó)內(nèi)研究的中國(guó)人類蛋白質(zhì)組組織（ChineseHUPO）和蛋白質(zhì)組專業(yè)委員會(huì)等也在籌備中。

　　發(fā)展趨勢(shì)

　　基礎(chǔ)研究方面

　　近兩年來(lái)蛋白質(zhì)組研究技術(shù)已被應(yīng)用到各種生命科學(xué)領(lǐng)域，如細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等。在研究對(duì)象上，覆蓋了原核微生物、真核微生物、植物和動(dòng)物等范圍，涉及到各種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)折疊等等。在未來(lái)的發(fā)展中，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域?qū)⒏訌V泛。

　　應(yīng)用研究方面

　　蛋白質(zhì)組學(xué)將成為尋找疾病分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一。在對(duì)癌癥、早老性癡呆等人類重大疾病的臨床診斷和治療方面蛋白質(zhì)組技術(shù)也有十分誘人的前景，目前國(guó)際上許多大型藥物公司正投入大量的人力和物力進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)方面的應(yīng)用性研究。

　　技術(shù)發(fā)展方面

　　蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法將出現(xiàn)多種技術(shù)并存，各有優(yōu)勢(shì)和局限的特點(diǎn)，而難以象基因組研究一樣形成比較一致的方法。除了發(fā)展新方法外，更強(qiáng)調(diào)各種方法間的整合和互補(bǔ)，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要，這種交叉是新技術(shù)新方法的活水之源，特別是，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它大規(guī)?？茖W(xué)如基因組學(xué)，生物信息學(xué)等領(lǐng)域的交叉，構(gòu)成組學(xué)（omics）生物技術(shù)研究方法，所呈現(xiàn)出的系統(tǒng)生物學(xué)（SystemBiology）研究模式，將成為未來(lái)生命科學(xué)最令人激動(dòng)的新前沿。