液質(zhì)聯(lián)用

　　簡介

　　色譜的優(yōu)勢在于分離，為混合物的分離提供了最有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)品對比來判斷未知物，對無紫外吸收化合物的檢測還要通過其它途徑進行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進行純化，具有一定的純度之后才可以直接進行分析。

　　因此，人們期望將色譜與質(zhì)譜聯(lián)接起來使用以彌補這兩種儀器各自的缺點。

　　HPLC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個方面的優(yōu)點：

　?、俜治龇秶鷱V，MS幾乎可以檢測所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題；

　?、诜蛛x能力強，即使被分析混合物在色譜上沒有完全分離開，但通過MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來進行定性定量；

　?、鄱ㄐ苑治鼋Y(jié)果可靠，可以同時給出每一個組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；

　　④檢測限低，MS具備高靈敏度，通過選擇離子檢測（SIM）方式，其檢測能力還可以提高一個數(shù)量級以上；

　?、莘治鰰r間快，HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時間，提高了分離效果；

　?、?span id="jj5hb7x" class='hrefStyle'>自動化程度高，HPLC-MS具有高度的自動化。

　　原理

　　液質(zhì)聯(lián)用( HPLC-MS) 又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后， 經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。

　　發(fā)展

　　接口技術(shù)

　　自20 世紀(jì)70 年代初，人們開始致力于液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)的研究。在開始的20 年中處于緩慢的發(fā)展階段，研制出了許多種聯(lián)用接口，但均沒有應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)[1]  。直到大氣壓離子化（atmospheric-pressure ionization， API）接口技術(shù)的問世，液-質(zhì)聯(lián)用才得到迅猛發(fā)展，廣泛應(yīng)用于實驗室內(nèi)分析和應(yīng)用領(lǐng)域。

　　液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)主要是沿著三個分支發(fā)展的：

　?。?）流動相進入質(zhì)譜直接離子化，形成了連續(xù)流動快原子轟擊（continuous-flow fast atom bombarment， CFFAB）技術(shù)等；（2）流動相霧化后除去溶劑，分析物蒸發(fā)后再離子化，形成了“傳送帶式”接口（moving-belt interface）和離子束接口（particle-beam interface）等；（3）流動相霧化后形成的小液滴解溶劑化，氣相離子化或者離子蒸發(fā)后再離子化，形成了熱噴霧接口（thermo spray interface）、大氣壓化學(xué)離子化（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）和電噴霧離子化（electrospray ionization， ESI）技術(shù)等。有關(guān)液相質(zhì)譜的接口技術(shù)和LC-MS 技術(shù)的發(fā)展，Niessen 曾經(jīng)進行了較為詳細的綜述。

　　目前應(yīng)用最廣泛的離子源有電噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源。其顯著優(yōu)勢有：可將質(zhì)荷比降低到各種不同類型的質(zhì)量分析器都能檢測的程度，在帶電狀態(tài)進行檢測從而計算離子的真實分子量，可以生成高度帶電且不發(fā)生碎裂的離子，同時，對于分子離子的同位素峰也可確定其分子量和帶電數(shù)。大氣壓化學(xué)離子化（APCI）技術(shù)與ESI源的發(fā)展基本上是同步的，其離子化過程主要是借助于電暈放電啟動一系列氣相反應(yīng)來完成，整個電離過程是在大氣壓條件下完成的。ESI和APCI的共同點是離子化效率高，從而顯著增強分析的靈敏度和穩(wěn)定性，大多與離子阱質(zhì)譜儀和三重四極桿質(zhì)量分析器聯(lián)用。

　　電噴霧離子化技術(shù)

　　電噴霧（ESI）技術(shù)作為質(zhì)譜的一種進樣方法起源于20 世紀(jì)60 年代末Dole等人的研究，直到1984 年Fenn實驗組對這一技術(shù)的研究取得了突破性進展。1985 年，將電噴霧進樣與大氣壓離子源成功連

　　接。1987 年，Bruins 等人發(fā)展了空氣壓輔助電噴霧接口，解決了流量限制問題，隨后第一臺商業(yè)化生產(chǎn)的帶有API 源的液-質(zhì)聯(lián)用儀問世。ESI 的大發(fā)展主要源自于使用電噴霧離子化蛋白質(zhì)的多電荷離子在四極桿儀器上分析大分子蛋白質(zhì)，大大拓寬了分析化合物的分子量范圍。

　　ESI 源主要由五部分組成：（1）流動相導(dǎo)入裝置；（2）真正的大氣壓離子化區(qū)域，通過大氣壓離子化產(chǎn)生離子；（3）離子取樣孔；（4）大氣壓到真空的界面；（5）離子光學(xué)系統(tǒng)，該區(qū)域的離子隨后進入質(zhì)量分析器。在ESI 中，離子的形成是分析物分子在帶電液滴的不斷收縮過程中噴射出來的，即離子化過程是在液態(tài)下完成的。液相色譜的流動相流入離子源，在氮氣流下汽化后進入強電場區(qū)域，強電場形成的庫侖力使小液滴樣品離子化，離子表面的液體借助于逆流加熱的氮氣分子進一步蒸發(fā)，使分子離子相互排斥形成微小分子離子顆粒。這些離子可能是單電荷或多電荷，取決于分子中酸性或堿性基團的體積和數(shù)量。

　　電噴霧離子化技術(shù)的優(yōu)點：可以生成高度帶電的離子而不發(fā)生碎裂，可將質(zhì)荷比降低到各種不同類型的質(zhì)量分析器都能檢測的程度，通過檢測帶電狀態(tài)可計算離子的真實分子量，同時，解析分子離子的同位素峰也可確定帶電數(shù)和分子量。另外，ESI 可以很方便地與其它分離技術(shù)聯(lián)接，如液相色譜、毛細管電泳等，可方便地純化樣品用于質(zhì)譜分析。因此在藥殘、藥物代謝、蛋白質(zhì)分析、分子生物學(xué)研究等諸多方面得到廣泛的應(yīng)用。其主要優(yōu)點是：離子化效率高；離子化模式多，正負離子模式均可以分析；對蛋白質(zhì)的分析分子量測定范圍高達105 以上；對熱不穩(wěn)定化合物能夠產(chǎn)生高豐度的分子離子峰；可與大流量的液相聯(lián)機使用；通過調(diào)節(jié)離子源電壓可以控制離子的斷裂，給出結(jié)構(gòu)信息。

　　大氣壓化學(xué)離子化技術(shù)

　　大氣壓化學(xué)離子化（APCI）技術(shù)應(yīng)用于液-質(zhì)聯(lián)用儀是由Horning 等人于20 世紀(jì)70 年代初發(fā)明的，直到20 世紀(jì)80 年代末才真正得到突飛猛進的發(fā)展，與ESI 源的發(fā)展基本上是同步的。但是APCI 技術(shù)不同于傳統(tǒng)的化學(xué)電離接口，它是借助于電暈放電啟動一系列氣相反應(yīng)以完成離子化過程，因此也稱為放電電離或等離子電離。從液相色譜流出的流動相進入一具有霧化氣套管的毛細管，被氮氣流霧化，通過加熱管時被汽化。在加熱管端進行電暈尖端放電，溶劑分子被電離，充當(dāng)反應(yīng)氣，與樣品氣態(tài)分子碰撞，經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)后生

　　成準(zhǔn)分子離子。然后經(jīng)篩選狹縫進入質(zhì)譜計。整個電離過程是在大氣壓條件下完成的。

　　APCI 的優(yōu)點：形成的是單電荷的準(zhǔn)分子離子，不會發(fā)生ESI 過程中因形成多電荷離子而發(fā)生信號重疊、降低圖譜清晰度的問題；適應(yīng)高流量的梯度洗脫的流動相；采用電暈放電使流動相離子化，能大大增加離子與樣品分子的碰撞頻率，比化學(xué)電離的靈敏度高3 個數(shù)量級；液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)質(zhì)譜成為精確、細致分析混合物結(jié)構(gòu)信息的有效技術(shù)。

　　分類

　　伴隨著液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜儀器本身也在不斷發(fā)展，出現(xiàn)了多種類型的質(zhì)譜檢測器。目前比較常用的質(zhì)譜儀器有：四極桿質(zhì)譜儀、四極桿離子阱質(zhì)譜儀、飛行時間質(zhì)譜儀和離子回旋共振質(zhì)譜儀等。

　　四極桿質(zhì)譜

　　目前，四極桿質(zhì)量濾器的應(yīng)用仍然最為廣泛。三級四極桿質(zhì)譜儀的選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected-reaction monitoring， SRM）模式適于進行常規(guī)的和高通量的生物分析。四極桿工藝的改進和強

　　穩(wěn)定性的射頻（RF）大大提高了質(zhì)譜的分辨率，分辨質(zhì)量數(shù)的寬度達到0.1Da，提高了分析化合物的選擇性。隨著對三級四極桿質(zhì)譜中碰撞池的改進，出現(xiàn)了高壓線形加速碰撞池，提高了對傳送離子的能力，降低了物質(zhì)間的干擾，大大提高了對多組分生物化合物的分析能力。在所有的質(zhì)譜分析儀中，四極桿質(zhì)譜儀的定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度最好。

　　四極桿離子阱質(zhì)譜

　　在闡明化合物的結(jié)構(gòu)方面，三維的四極桿離子阱得到廣泛的應(yīng)用。與此相關(guān)的革新主要有基質(zhì)輔助激光解吸離子化源、大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸離子化源、紅外多光子光離解技術(shù)的發(fā)展，以及使

　　用離子阱分析堿性加合離子與金屬配位產(chǎn)物的研究。近些年，線形二維離子阱的生產(chǎn)，取得了突破性的進展。這種線形二維離子阱與三維離子阱一樣可以對化合物做多級質(zhì)譜分析，此外還可以積累更多的離子，提高了檢測的靈敏度。在與線形加速碰撞池離子化源連接后，可大大提高靈敏度，避免小分子量碎片的干擾，得到更整潔、美觀的色譜峰。

　　飛行時間質(zhì)譜

　　隨著基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)的出現(xiàn)和計算機的發(fā)展，飛行時間質(zhì)譜儀在20 世紀(jì)90 年代得到快速發(fā)展。目前，最好的飛行時間質(zhì)譜分析儀分辨率能夠達到20，000 Da，測得分子的質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度非常高。飛行時間質(zhì)譜儀在很大程度上取代了高分辨雙聚焦磁扇分析儀，但其不能有效地利用選擇離子監(jiān)測模式進行分析。在高分辨質(zhì)譜的選擇離子監(jiān)測模式分析中仍然主要使用雙聚焦質(zhì)譜儀。為了使用分辨率高的質(zhì)譜分析化合物的二級質(zhì)譜圖，人們嘗試將飛行時間質(zhì)譜與其它質(zhì)譜串聯(lián)使用，目前使用比較多的是具有突破性技術(shù)的新一代四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(AB SCIEX TripleTOF 5600+)，確保系統(tǒng)能獲得高準(zhǔn)確度的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和定量檢出限。

　　傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜

　　許多年以來，傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry， FT-ICR-MS）在氣相離子-分子反應(yīng)的基礎(chǔ)研究中成為有效的手段。該質(zhì)譜與ESI離子源聯(lián)接后被廣泛地應(yīng)用于生物大分子的研究，能夠充分發(fā)揮其高分辨率和準(zhǔn)確度的優(yōu)勢。基于傅立葉變換離子回旋共振池內(nèi)離子的四極激發(fā)，該質(zhì)譜可以選擇地累積非共價鍵復(fù)雜化合物的離子，使其能夠分析分子量非常大的生物大分子化合物，如分析分子量高達108Da 的大腸桿菌噬菌體的T4DNA，成為該質(zhì)譜儀發(fā)展的重要里程碑。該質(zhì)譜儀通過射頻脈沖消除其它離子的干擾選擇性地捕獲目標(biāo)離子到離子回旋共振池內(nèi)，也能夠進行多級質(zhì)譜分析。當(dāng)前又有許多新的離子裂解方法應(yīng)用到傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀，如碰撞誘導(dǎo)裂解、激光致光裂解或紅外多光子光裂解、表面誘導(dǎo)裂解、黑體紅外輻射裂解、電子捕獲裂解等，又進一步改善了這種質(zhì)譜儀分析的性能。

　　除上面描述的常見的幾種接口技術(shù)和質(zhì)譜儀之外，還有其它的一些產(chǎn)品不斷問世。近十年來，人們在液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的研究方面已經(jīng)將研究的重點轉(zhuǎn)移到研制適合某種分析領(lǐng)域的強優(yōu)勢的技術(shù)，并加速產(chǎn)品的商業(yè)化。總之，液-質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)的發(fā)展取決于液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)和質(zhì)譜分析儀技術(shù)的共同發(fā)展。通過合適的接口將液相色譜與質(zhì)譜儀聯(lián)接，會獲得具有特殊分析性能的液-質(zhì)聯(lián)用儀器，另外通過接口將質(zhì)譜與質(zhì)譜進行串聯(lián)，可以彌補各種質(zhì)譜儀的不足，達到取長補短，協(xié)同提高的效果。

　　應(yīng)用

　　隨著聯(lián)用技術(shù)的日趨完善，HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。特別是在分子水平上可以進行蛋白質(zhì)、多肽、核酸的分子量確認，氨基酸和堿基對的序列測定及翻譯后的修飾工作等，這在HPLC-MS聯(lián)用之前都是難以實現(xiàn)的。HPLC-MS作為已經(jīng)比較成熟的技術(shù)，目前己在生化分析、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

　　生化分析

　　生物體內(nèi)的化合物具有強極性、難揮發(fā)性，并且具有顯著的熱不穩(wěn)定性，同時，這些化合物往往以蛋白質(zhì)、肽和核酸的混合物狀態(tài)出現(xiàn)，而液相色譜對于不易揮發(fā)、強極性、對熱不穩(wěn)定及高分子量化合物的分離能力高；質(zhì)譜可以對復(fù)雜混合物中的化合物進行準(zhǔn)確定性，所以液質(zhì)聯(lián)用作為生化分析的一個有力工具，日益得到重視。

　　Henry等對液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在單克隆抗體結(jié)構(gòu)表征上的應(yīng)用進行了研究，先采用液質(zhì)聯(lián)用對曲妥珠單抗完整蛋白及其亞基（輕鏈和重鏈）的相對分子質(zhì)量進行測定；然后用多種酶（胰蛋白酶和 Asp N）酶解蛋白并用液質(zhì)聯(lián)用肽圖分析法對曲妥珠單抗的氨基酸全序列進行解析和確定，同時對可能發(fā)生的翻譯后修飾（PTMs）進行定性和定量分析；再通過PNGase F酶來釋放抗體上的糖鏈并應(yīng)用液相色譜熒光檢測與質(zhì)譜聯(lián)用方法對其糖基化修飾進行結(jié)構(gòu)分析及確認，建立了一套單克隆抗體結(jié)構(gòu)表征的平臺化方案。

　　天然產(chǎn)物分析

　　利用HPLC-MS分析混合樣品，和其他方法相比具有高效快速，靈敏度高，樣品只需進行簡單預(yù)處理或衍生化，尤其適用于含量少、不易分離得到或在分離過程中易的組分。因此HPLC-MS技術(shù)為天然產(chǎn)物研究提供了一個高效、切實可行的分析途國內(nèi)利用該技術(shù)在天然產(chǎn)物研究中已經(jīng)有很多報道。如李麗等利用高效液相色質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了朝鮮淫羊蕾中的黃酮類化合物。

　　藥物分析

　　在藥物分析研究領(lǐng)域中，大部分藥物是極性較大的化合物，而在諸多分析儀器中，液相色譜分析范圍廣，包括不揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）。質(zhì)譜特異性強，可以提高較多的結(jié)構(gòu)定性信息，而且檢測靈敏度很高。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能夠?qū)?zhǔn)分子離子進行多級裂解，從而提供化合物的相對分子量以及豐富的碎片信息。在藥物研發(fā)中的雜質(zhì)研究和藥物動力學(xué)研究階段，通常雜質(zhì)和藥代動力學(xué)樣品的血藥濃度的含量很低，分析難度大且干擾多，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)由于其選擇性強和靈敏度高，可以快速準(zhǔn)確地測定藥物分析中的痕量物質(zhì)。

　　任雪等采用液質(zhì)聯(lián)用對國產(chǎn)鮭降鈣素注射液中的主要降解雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定。賈薇采用液質(zhì)聯(lián)用法分析生物樣品中四環(huán)素類藥物和金剛乙胺的代謝物，結(jié)果顯示，牛奶中四環(huán)素，土霉素及美他環(huán)素濃度在0.05 μg/mL，金霉素在0.1 μg/mL時可以準(zhǔn)確可靠地被檢出。賈連群等采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究脾虛大鼠血清代謝物譜群特征，對大鼠進行血清代謝組學(xué)檢測，應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析研究組間代謝物譜圖差異，并通過變量重要性投（OPLS-DA）選取血清中與證型相關(guān)的生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，脾氣虛及脾陽虛模型大鼠血清中多種代謝物的相對含量發(fā)生了顯著變化，并初步獲得了一些可能與脾虛證候相關(guān)的潛在小分子生物標(biāo)志物。曹文利利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對白芍總苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷在大鼠體內(nèi)的代謝物進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，代謝位點主要為糖苷鍵、酯鍵、苯環(huán)，膽汁中白芍總苷的代謝物明顯多于單體狀態(tài)。

　　食品安全分析

　　各種抗生素，抗菌藥， 激素及農(nóng)藥等對畜禽和農(nóng)作物防病治病，促進生長有顯著作用， 是發(fā)展畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的行之有效的措施，同時這些物質(zhì)在動植物體中的殘留會通過食物鏈的富集作用轉(zhuǎn)移到人體，危害人類健康。能否準(zhǔn)確的檢測這些有害物質(zhì)，是保證食品安全的關(guān)鍵。

　　常用的檢測技術(shù)， 如 ELISA法、 CHAR MII 法、生物傳感器等由于不能提供分子結(jié)構(gòu)，難以同時檢測分析多種藥物而且不能有效的排除假陽性，具有一定的局限性。而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不但能夠定性定量的檢測禽畜肉和農(nóng)作物等食品中的藥物殘留，提供檢測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息而且精密度高， 重現(xiàn)性好，能夠排除假陽性檢測結(jié)果。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能夠快速簡便的檢測肉制品中的氯霉素、 氟苯尼考、雪卡毒素等有害物質(zhì)，特別是在檢測農(nóng)藥殘留方面，快捷有效。如于維森等應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，可一次性檢測 33 中農(nóng)藥， 快速精確， 且達到了殘留量檢測中所要求的檢測濃度水平。裴燕采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對肉雞肌肉和肝臟中金霉素及其代謝物的殘留量和排泄量進行了檢測，結(jié)果表明，服用金霉素后，肉雞的肌肉、肝臟和排泄物中均有金霉素及其代謝物均被檢出。劉棟采用液質(zhì)聯(lián)用對多種貝類毒素進行研究，為我國貝類及其產(chǎn)品中貝毒的檢測分析提供了具體的方法和技術(shù)規(guī)范。

　　環(huán)境分析

　　當(dāng)今環(huán)境的污染主要有工廠排出的污水和廢氣電池等攜帶的重金屬對河流和土壤造成的污染，農(nóng)田中的殺蟲劑和化肥殘留造成的污染，環(huán)境激素的污染及多環(huán)芳烴類化合物的污染等。為了適應(yīng)可持續(xù)發(fā)展的要求，做好防治環(huán)境污染的工作，實現(xiàn)綠色發(fā)展， 找到有效的污染物分析手段勢在必行。

　　液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是一種功能強大的分析技術(shù)，在多環(huán)芳烴及其硝基衍生物的分析能達到令人滿意的效果是分析其的理想方法，可用來準(zhǔn)確定量分析 AS 的各種化合物及硒化合物，還能應(yīng)用于苯脲， 三嗪， 氨基甲酸酯， 氯苯氧酸和硝基酚等的分析 。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析，樣品處理簡單，對樣品限制性小， 且檢測靈敏度高， 分離能力強 ，靈活性大，是有效分析檢測環(huán)境污染物的重要手段，在環(huán)境污染分析方向有著顯著優(yōu)勢。

　　前景

　　液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其高效快速的分離能力、超高的靈敏度在很多領(lǐng)域得到的廣泛的應(yīng)用。隨著科技軟件的發(fā)展，檢測技術(shù)在液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的支持下開始了很廣泛的應(yīng)用 ，準(zhǔn)確度也變得高了很多，檢測技術(shù)也在隨之發(fā)生著不斷的改進與發(fā)展。此外，隨著現(xiàn)代化高新技術(shù)的不斷發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將液相色譜和質(zhì)譜結(jié)合起來，既體現(xiàn)了液相色譜的高分離性能， 又體現(xiàn)了質(zhì)譜強大的鑒別能力， 在分析檢測方面有著不可磨滅的優(yōu)勢，對多數(shù)物質(zhì)的檢測靈敏度超過了其他方法，在化工， 醫(yī)藥， 食品， 生物等各個領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的地位，真正的體現(xiàn)了現(xiàn)代各類物質(zhì)分析中高通量和高精度的要求。